Specialagent Leroy Jethro Gibbs lämnade NCIS i slutet av säsong tre efter att en terroristattack hade varit framgångsrik eftersom hans överordnade inte lyssnade på hans varningar i tid. Laget leds nu av Anthony DiNozzo under en kort tid fram till Gibbs eventuella återkomst. Nya karaktärer som introducerades under den här säsongen är Michelle Lee, som en kort tid var med i DiNozzos team och överfördes till den juridiska avdelningen när Gibbs återvände, och (redan i de sista avsnitten av säsong 3) Gibbs tidigare chef och mentor Mike Franks, både som återkommande karaktärer. Också, om än senare under säsongen, introduceras överstelöjtnant Hollis Mann i Army CID som ett annat kärleksintresse för Gibbs.